Лаборатория молекулярной вирусологии и генной инженерии

 Заведующий лабораторией — к. м. н. Грудинин Михаил Павлович

 Телефон зав. лабораторией: +7 (812) 499–15–21
 Телефон лаборатории: +7 (812) 499–15–20

 E-mail: mikhail.grudinin@influenza.spb.ru

Лаборатория молекулярной вирусологии и генной инженерии была организована в 1987 году. В лаборатории, в рамках системы глобального надзора за гриппом, с помощью современных методов молекулярной вирусологии ежегодно проводится исследование генетического разнообразия и молекулярно-биологических свойств вирусов гриппа А и В, а также изучение эволюции вирусов гриппа, циркулирующих на территории РФ.

Лаборатория имеет лицензию №001262 на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний и выполнение работ с микроорганизмами III — IV групп патогенности (Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 20.02.2006).

Основные направления деятельности лаборатории

  • Изучение структуры геномных сегментов, кодирующих как поверхностные, так и внутренние белки вирусов гриппа; анализ мутаций, ответственных за развитие лекарственной устойчивости; выявление изменений в антигенных сайтах и функциональных участках генома вируса гриппа.
  • Изучение молекулярных механизмов патогенеза гриппа на моделях экспериментальной гриппозной инфекции.
  • Разработка олигонуклеотидных и белковых микрочипов (microarray) для экспериментальных и клинических исследований.
  • Изучение молекулярных механизмов самосборки белковых комплексов и конструирование наноматериалов на их основе.
  • Разработка и изучение противогриппозных вакцин нового поколения и рекомбинантных гриппозных векторов, экспрессирующих вирусные, бактериальные антигены и биологически активные вещества.
  • Изучение генетического разнообразия вирусных и бактериальных инфекций.

Основные достижения

В эпидемический сезон 2006–2009 годов проанализированы более 200 штаммов вирусов гриппа А и В, проведен анализ устойчивости к «Озелтамивиру» 110 штаммов сезонного вируса гриппа А субтипа H1N1. Показано, что в эпидемический сезон 2008–2009 годов в России циркулировали вирусы гриппа А подпипов H1N1 (клайды 2B и 2С), H3N2, В и пандемический вирус H1N1V.

Среди вирусов гриппа A H1N1 превалировали штаммы, относящиеся к клайду 2В. Вирусы гриппа A подтипа H3N2 2008–2009 годов относились к генотипу D, были устойчивы к ремантадину, чувствительны к озелтамивиру. Среди российских штаммов вирусов гриппа А H3N2 2009 года выделения не было выявлено штаммов, подобных штамму Perth/16, рекомендованному для производства гриппозных вакцин. В 2009 году наблюдалось возвращение в циркуляцию Vic87-подобных вирусов гриппа B (III–II), которые вытеснили Yam88-подобные вирусы, преобладавшие в 2008 году. Проанализированные штаммы пандемического вируса гриппа А/H1N1v устойчивы к ремантадину (несут мутацию S31N) и чувствительны к «Озелтамивиру».

Установлено, что отдельные белки вируса гриппа (HA, NA и M) способны вызывать патологические нарушения, характерные для гриппозной инфекции как in vitro, так и in vivo. При этом, HA, NA и M белки способны модулировать фибринолитическую и антикоагулянтную активность плазмы крови, изменять активность эритроцитов (HA) и тромбоцитов (HA, NA и M), усиливать частоту сокращения лимфатических сосудов (HA, NA и M), блокировать CD-4 рецептор Т-клеток (HA и M белки, на 20% и 70%, соответственно), вызывать пролиферацию лейкоцитов периферической крови и экспрессию CD25-рецепторов (ИЛ 2). Механизм действия вирусных белков на все эти процессы в организме хозяина можно объяснить наличием в структуре вирусных белков аминокислотных последовательностей, мимикрирующих аминокислотные последовательности ряда регуляторных белков и пептидов хозяина таких, как тканевой активатор плазминогена человека, инсулин, соматостатин, опиоидные, гастроинтестинальные пептиды и др. Начаты исследования о повреждающем действии вируса гриппа на эндотелий сосудов. Получены данные, свидетельствующие о том, что вирусы гриппа А: H5N1, H3N2, H1N1 могут полноценно репродуцироваться в культуре эндотелиальных клеток и оказывать на них повреждающее действие, которое выражается в апоптозе данной культуры.

Разработан опытный образец олигонуклеотидного микрочипа для выявления вирусов гриппа типа А подтипа H5N1 в клиническом материале.

Разработаны оригинальные подходы для регулирования самосборки полипептидов.

С помощью методов обратной генетики получены 6 вакцинных кандидатов, являющихся 5:3 и 6:2 реассортантами высокоурожайного вируса PR/8/34 (H1N1) и вирусов гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1), A/Texas/04/09 (H1N1).

Созданы рекомбинантные гриппозные векторы, экспрессирующие микобактериальный антиген ESAT-6. Показана профилактическая и терапевтическая эффективность рекомбинантных гриппозных векторов на моделях экспериментальной туберкулезной инфекции.

Впервые получена оригинальная бактериальная система экспрессии рекомбинантного гена антигена Дельта, в которой осуществляется одновременный синтез малой и большой форм антигена ВГД по эукариотическому типу экспрессии, на основе штамма E.coli XL1-Blue, несущего Sup E мутацию, содержащего плазмиды рUC-D или pGEX-D.

Амплифицированы, секвенированы и клонированы гены, кодирующие структурную часть белков 14.3.3 и приона человека (эмбриональный мозг), полноразмерный ген антигена ВГД (сыворотка больного).

Определение первичной нуклеотидной последовательности полноразмерных геномов двух изолятов вируса гриппа H5N1 из г. Кургана и двух крымских изолятов, выделенных во время вспышки заболевания среди домашней птицы в 2005 году. Все полученные последовательности были депонированы в Международную базу данных GenBank с кодами доступа DQ449632–DQ449647; DQ650659–DQ650670. Филогенетический анализ первичных нуклеотидных последовательностей всех генов данных изолятов выявил высокий уровень гомологии гемагглютининов западносибирских штаммов со штаммами, изолированными весной того же года в северо-западной провинции Цинхай (КНР). Было показано, что данные изоляты кластеризуются со штаммами так называемой Цинхайской группы и относятся ко 2 субклайду 2 клайда вируса гриппа А H5N1 по классификации ВОЗ и близки к рекомендованному ВОЗ вакцинному кандидату An A/Bar headed goose/Quinghai/1A/2005-like virus, полученному методом обратной генетики (2006).

Впервые выявлена циркуляция генотипа II вируса гепатита Дельта в Якутии. Ранее данный генотип выявлялся только в Тайване и Японии. Филогенетический анализ с применением компьютерных программ CLUTAL W (1.8), PHILIP и PAUP показал, что российский ВГД генотипа II формирует отдельную ветвь между тайваньскими и японскими изолятами. Филогенетический анализ полноразмерных последовательностей генома вируса гепатита В (ВГВ), полученных из GenBank/EMBL, что позволил выявить высокую частоту рекомбинантных событий в эволюционной истории ВГВ. Для 9 мозаичных геномов картированы предполагаемые точки рекомбинации. Шесть мозаичных геномов образовались в результате рекомбинации между генотипами В и С и были изолированы в Юго–Восточной Азии, где данные генотипы циркулируют совместно. Три мозаичных генома представляли А/D рекомбинанты. Все они были выделены в Италии, где А и D генотипы составляют 90% популяции ВГВ. Среди ВГВ, циркулирующих в Санкт-Петербурге, выявлен вариант, образовавшийся в результате рекомбинации генотипов А и D. В трех образцах, полученных от пациентов, выходцев из Юго-Восточной Азии, был обнаружен генотип С. Таким образом, было показано, что в Санкт-Петербурге, как и в Западной Европе происходит расширение спектра генотипов ВГВ за счет миграции населения.

Современные/уникальные методы исследования, применяемые в лаборатории

ПЦР, ОТ-ПЦР, Real-Time ПЦР, RFLP-анализ, высокоэффективная жидкостная хроматография, спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, метод динамического светорассеивания, микробиочипы, комплекс компьютерных программ  для анализа нуклеотидных и белковых последовательностей, моделирования пространственной структуры полипептидов и образования белковых комплексов и др.

Оснащение лаборатории

Лаборатория имеет оснащенные необходимым оборудованием ПЦР-боксы, соответствующие «Методическим рекомендациям по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции», утвержденных в 1995 году ГК СЭН. В лаборатории имеется следующее оборудование: ламинарные боксы, низкотемпературные установки, термоциклеры, приборы Real-Time ПЦР, прибор для регистрации результатов ПЦР по конечной точке «Алладин», центрифуги, УФ-трансиллюминатор, вакуумный отсасыватель и пр.). В лаборатории имеется секвенатор (ABI Prism-3100) для определения первичных нуклеотидных последовательностей, а также необходимое для анализа полученных результатов современное программное обеспечение (построение филогенетических деревьев, нуклеотидных и белковых элайнментов). Имеется микробиологические боксы для работы с бактериями и проведения генно-инженерных работ по получению рекомбинантных ДНК, созданию продуцентов вирусных белков и их фрагментов и для осуществления непрямого секвенирования. Имеется изолированный, оснащенный современным оборудованием блок, отвечающий уровню биобезопасности BSL-2 по международным стандартам, для проведения работ по конструированию вирусных векторов и вакцин методами обратной генетики.


Для внедрения технологии ДНК и белковых микрочипов в лаборатории имеется споттер SpotArray24 («Perkin-Elmer», USA), гибридизационная станция Protein Array Workstation («Perkin-Elmer», USA), флюоресцентный сканер ScanArray Express (Perkin-Elmer, USA). Также имеется все необходимое высокотехнологичное оборудование (Thermomixer comfort (Eppendorf, Germany), Центрифуга 5804R (Eppendorf, Germany), Центрифуга типа Concentrator 5301+ (Eppendorf, Germany), Спектрофотометр NanoDrop ND-1000, Амплификатор Mastercycler Personal (Eppendorf, Germany), KODAK Image Station 2000R) для осуществления промежуточных стадий анализа с применением данного метода.

Межинститутские и международные научные связи в рамках грантов, проектов, программ

  • Грант МНТЦ (№3070). Дальнейшее усовершенствование надзора за гриппом в России. Вклад в глобальную подготовку к пандемии гриппа.
  • Грант МНТЦ (№3373). Совершенствование и стандартизация лабораторных и эпидемиологических методов надзора за краснухой в Российской Федерации.
  • Европейский проект №512864 «Химерные вакцины». Разработка delNS1 вирусов гриппа в качестве векторов для доставки чужеродных антигенов.
  • Европейский проект «FLUVACC». Живая аттенуированная гриппозная вакцина, дефектная по репликации.
  • Государственный контракт №02.513.11.3231 между Федеральным агенством по науке и инновациям и НИИ гриппа на выполнение в рамках Федеральной целевой программы (ФЦП) «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно–технического комплекса России на 2007–2012 годы» научно-исследовательской работы по теме: «Разработка научно–технических основ создания функциональных полимерных наноматериалов с регулируемой структурой на основе полипептидов.
  • Индивидуальный грант правительства Санкт-Петербурга для молодых кандидатов 2007 года «Создание олигонуклеотидного биочипа для выявления и субтипирования вирусов гриппа типа А человека» PD07–1.4–116. (Васин А. В.).
  • НИИДИ, Санкт-Петербург;
  • Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург;
  • Институт элементоорганических соединений им. акад. Несмеянова РАН, Москва;
  • Институт здоровья, Саха-Якутия;
  • Петрозаводский государственный университет;
  • ФГУ Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии Росмедтехнологий;
  • МГУ, кафедра физиологии человека и животных, Москва;
  • НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург;
  • ГУ НИИЭМ РАМН;
  • ПИЯФ РАН;
  • НИИПББ НЦБ РК КН МОН республики Казахстан;
  • Шведский Совет по научным исследованиям, Шведский Секретариат Полярных Исследований;
  • Институт прикладной микробиологии (Австрия, Вена);
  • Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG (Австрия, Вена).

Патенты

  • «Рекомбинантные штаммы вируса гриппа, экспрессирующие микобактериальный протективный антиген ESAT-6, и их использование для профилактики и лечения туберкулеза».
    А. Ю. Егоров, О. И. Киселев, М. А. Стукова, Г. Катингер.
  • «Средство для лечения гриппа».
    И. П. Ашмарин, И. Н. Жилинская, Л. В. Осидак, О. И. Киселев
    Регистрационный номер 2229877

Научные экспедиции

Избранные публикации

  • «Genomic structure of highly pathogenic influenza H5N1 viruses. Identification of Ebola like immunosupressive domain in NS2 protein»
    O. Kiselev, V. Blinov, M. Pisareva, M. Grudinin.
    International conference «Options for the Control of Influenza VI», June, 17-23, 2007/ Manuscript. Online
  • «Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNS1 H5N1 influenza vaccine»
    J. Romanova, B. M. Krenn, M. Wolschek, B. Ferko, E. Romanovskaja-Romanko, A. Morokutti, A. P. Shurygina, S. Nakowitsch, T. Ruthsatz, B. Kiefmann, U. König, M. Bergmann, M. Sachet, S. Balasingam, A. Mann, J. Oxford, M. Slais, O. Kiselev, T. Muster, A. Egorov.
    PLoS One. 2009 Jun 19;4(6):e5984.
  • «Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса гриппа субтипа H5N1, выделенных от домашней птицы в Кургане в 2005 году»
    М. М. Писарева, В. М. Блинов, В. А. Терновой, Д. В. Сараев, М. Ю. Еропкин, Т. Г. Лобова, В. А. Григорьева, М. П. Грудинин, О. И. Киселев
    Молекулярная биология. — 2008. — № 1.
  • «Gene segment reassortment between American and Eurasian lineages of avian influenza virus from waterfowl in the Beringia area»
    J. Wahlgren, J. Waldenstrom, S. Sahlin, P. D. M. Haemig, R. A. Fouchier, K. I. Falk, A. D. M. E. Osterhaus, J. Pinhassi, J. Bonnedahl, M. Pisareva, М. Grudinin, O. Kiselev, J. Hernandez, A. Lundkvist, B. Olsen
    PLoS ONE. 2008.
  • «Вопросы общей вирусологии: Учебное пособие»
    И. Н. Жилинская, А. А. Стамкулова, И. С. Фрейдлин, С. А. Кетлинский, О. К. Кузнецов, Л. А. Степанова, А. И. Мигунов, Е. П. Харченко, Ф. И. Ершов, А. А. Соминина, А. И. Банников, В.В Зарубаев, А. В. Васин, В. В. Егоров, Е. В. Сорокин, Т. Р. Царева. Под. ред. О. И. Киселева, И. Н. Жилинской
    СПб.: СПбГМА им. И. И. Мечникова, 2007. — 374 с.
  • «DNA–Polycation Complexes. Effect of Polycation Structure on Physico–chemical and Biological Properties»
    A. V. Slita, N. A. Kasyanenko, O. V. Nazarova, I. I. Gavrilova, E. M. Eropkina, A. K. Sirotkin, T. D. Smirnova, O. I. Kiselev, E. F. Panarin 
    J. Biotechnology. 2007. V. 127. P. 679-693.
  • «Амилоидогенный пептид, гомологичный участку бета-домена альфа-лактальбуминов» В. В. Егоров, Ю. П. Гармай, К. В. Соловьев, Н. А. Грудинина, Т. Д. Алейникова, А. К. Сироткин, О. И. Киселев, М. М. Шавловский.
    Доклады Академии Наук 414(6), 828–830.
  • «Atomic force microscopy study of peptides homologous to beta–domain of alpha–lactalbumins»
    V. V. Egorov, K. V. Solovyov, N. A. Grudinina, D. V. Lebedev, V. V. Isaev-Ivanov, O. I. Kiselev, M. M. Shawlovsky
    Protein and peptide letters 14(5): 411-414.
  • «Vaccine potential of influenza vectors expressing Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 protein»
    M. A. Stukova, S. Sereinig, N. V. Zabolotnyh, B. Ferko, C. Kittel, J. Romanova, T. I. Vinogradova, H. Hatinger, O. I. Kiselev, A. Egorov
    Tuberculosis (Edin.). — 2006. — V. 86. — № (3–4). — P. 236–46.
  • «Influenza vector expressing ESAT–6 protein of Mycobacerium tuberculosis protects animals against tuberculosis»
    S. Sereinig, M. A. Stukova, N. V. Zabolotnyh, B. Ferko, C. Kittel, J. Romanova, T. I. Vinogradova, H. Katinger, O. I. Kiselev, A. Egorov
    Clinical and vaccine immunology. — 2006. — V.13, № 8. — P. 898-904.
  • «Перспективы использования гриппозных векторов, экспрессирующих протективный микобактериальный антиген ESAT–6, для профилактики туберкулеза»
    М. А. Стукова, С. Серайниг, Н. В. Заболотных, Т. И. Виноградова, Ю. Р. Романова, Г. Катингер, Ю. Н. Левашев, О. И. Киселев, А. Ю. Егоров
    Медицинский академический журнал. — 2007. — Т.7. — № 4. — C. 56 -64.
  • «Homologous recombination between different genotypes of hepatitis B virus»
    V. M. Morozov, M. M. Pisareva, M. P. Groudinin.
    GENE, 2000, V. 260, pp. 55-65.
  • «Течение вирусных гепатитов В и С у детей при перинатальном инфицировании»
    Л. Г. Горячева, А. Л. Мукомолова, М. М. Писарева.
    Сборник научных трудов, посвященный 100–летию СПб ГПМА, Санкт Петербург, 2005, стр. 47-50.
  • «Влияние генотипических и фенотипических свойств вируса гепатита В на течение хронического гепатита»
    О. П. Дуданова, О. И. Яхонтова, О. И. Киселев, М. П. Грудинин, М. М. Писарева.
    Гепатология. — 2005. — № 3. — С. 3 — 10.
  • «Диагностические, клинические и морфологические особенности хронического гепатита В — «дикой» и «мутантной» форм»
    О. П. Дуданова, И. И. Яхонтова, Л. Н. Валенкевич, О. И. Киселев, М. П. Грудинин, М. М. Писарева.
    Мед. акад. журнал — 2006. — Т. 6, № 2. — С. 86 — 93.
  • «Новый комплексный препарат Но-шпа и Ремантадин эффективно подавляет репродукцию вируса гриппа птиц»
    И. Н. Жилинская, Н. И. Коновалова, О. И. Киселев, И. П. Ашмарин.
    Доклады Академии Наук, 2007 год, том 414, № 5, стр. 711-713.